(Inhibition of TGF-β with neutralizing antibodies prevents radiation-induced acceleration of metastatic cancer progression)

期刊：

临床研究期刊 (The Journal of Clinical Investigation)  Volume 117  Number 5  May 2007

作者

Swati Biswas,¹ Marta Guix,² Cammie Rinehart,² Teresa C. Dugger,² Anna Chytil,¹

Harold L. Moses,^1,3,4 Michael L. Freeman,⁵ and Carlos L. Arteaga^1,2,4

单位

属于美国田纳西州 那什维尔 范德堡大学(Vanderbilt University)

1.癌症生物学系、2.医学系、3.病理学系、4. Vanderbilt-Ingram癌症中心乳癌研究计划 以及 5.放射肿瘤学系

译注1：此为放射性治疗。

译注2：此为一癌症化学治疗常用药物，俗称「小红莓」。

译注3：此为感染此病毒之初期的产生的三种T抗原中其中一种。

除Smad族的蛋白质外，TGF-β还可以刺激数种转化的讯息传递路径。之前TGF-β已被证实可保护转化细胞(transformed cells)不受细胞凋亡之害。此类细胞反应有一种可能的机制，就是TGF-β诱发了PI3K和PI3K的标的物，也就是丝胺酸/酥胺酸激酶 Akt，此讯息传递程序和对于癌症药物的抗药性是相关连的。有些对传统化学疗法有抗药性的肿瘤会过度表现TGF-β，而TGF-β的抑制剂经证明可逆转此种抗药性。还有，大部分的肿瘤都会过度表现TGF-β配体(ligands)。在肿瘤组织与在血清中的高量TGF-β配体，与肿瘤转移的复发、患者较差的愈后，均有所相关。

在乳癌的基因转殖模型中，TGF-β之讯息传递可加强转移既存的乳腺肿瘤。这是受例如Neu/ErbB2或多腺瘤病毒中央Ｔ抗原(polyomavirus middle T antigen,PyVmT)等的癌症基因之诱发所致。再者，在MMTV/LTR乳腺启动子的控制下，表现PyVmT癌症基因的基因转殖鼠，经过有条件的TGF-β1诱导，只要两个礼拜之短，转移肺癌的机率便高了十倍。有些癌症治疗已被证实会全面性地、或留在原处诱发TGF-β。所以我们推测，被癌症治疗所诱发的TGF-β，会提供存活讯息给这些对化疗有抗药性的肿瘤里的细胞，或者一部分此种肿瘤中的细胞，使它们可能在治疗之后，立即加速肿瘤的扩展。在此，我们使用了乳癌转移的MMTV/PyVmT 基因转殖模型来展示，游离辐射(ionizing radiation)和小红莓(doxorubicin)提高了循环中的TGF-β1浓度、循环中的肿瘤细胞数、以及肺部的癌症转移。这些效应都藉由TGF-β中和抗体的施加，而得以抵销。在缺乏第二型TGF-β受器(TβRII)的老鼠身上，放射线则没有增加肺部的癌症转移。这些资料暗示，癌症治疗所产生的TGF-β是肿瘤中一个帮助癌症转移的讯号，因此也提供了原理根据，使我们在使用这些疗法时，得以同时搭配使用TGF-β的抑制剂。

胸腔的放射线处理及化学治疗，会增加循环中的肿瘤细胞量与增加肺部癌症转移。TGF-β增强了会表现PyVmT肿瘤基因之肿瘤细胞的存活率，而且之前已被证实，TGF-β有条件地被诱发后，会在MMTV/PyVmT基因转殖鼠中加速乳腺肿瘤的转移。因此，我们推测，因治疗而提升的循环中TGF-β1浓度，可能和这个乳癌转移模型中的循环中肿瘤细胞增加、肺部癌症转移增加，有所关连。带有肿瘤的MMTV/PyVmT老鼠在第八周大时，被施行胸腔放射处理(thoracic irradiation)(10 Gy)直至第十三周为止。实验终结时进行心脏穿刺以取得血液，而血液中的细胞部分，则拿去测试其在活体外生成细胞集落之能力。从未经放射处理之老鼠所取得之血液，产生了平均1.6 ± 1.5个细胞集落；而从经过放射处理之老鼠所取得之血液，于10-12天后所测量的结果是，产生了平均28.3 ± 7.6个细胞集落（P=0.02：图二A）。PyVmT抗体的免疫染色证实，这些生长的细胞集落有表现癌症基因（图二A）。循环中的活肿瘤细胞数有所增加；而和此相符合的是，我们在经放射处理的老鼠中，观察到较未经处理之控制组17倍的肺部表面癌症转移（P = 0.009；图二B）。在被用doxorubicin处理相较于未处理之老鼠中，也在肺部癌症转移观察到类似的上升情形（P = 0.032；图二C）。在施加doxorubicin 24小时之后，相较于未经处理之控制组老鼠所取得之血液，也观察到在细胞群落数目的上升（17.2 ± 3.7与7.2 ± 2 colonies; n = 5; P = 0.007)。从老鼠的体重及一系列的肿瘤直径数据来看，受处理与未处理的老鼠在肿瘤负荷量上并无差异，这表示TGF-β1浓度之差别，不能简单地以肿瘤负荷量会随时间增加来解释。

接下来，我们检验了放射线所诱发之肺部癌症转移，是否仅限于带有肿瘤的MMTV/PyVmT基因转殖鼠身上。为了测试这个可能性，我们从会表现PyVmT之基因转殖的乳腺癌中，取得表现luciferase的肿瘤细胞，然后将其注射至非基因转殖的同源FVB老鼠身上。这些老鼠中的肿瘤，生长在左侧鼠蹊(inguinal)（四号）的乳腺脂肪垫，我们以生物发光法，观察并估计了其转移扩散至肺脏的情形（图三A）。当肿瘤长到了200mm³或更大时，老鼠在胸腔施加了10 Gy 的放射线并在其余部分施加屏障，两周后将老鼠牺牲。相较于控制组，接受放射处理的老鼠增加了三倍的表面肺部癌症转移(P = 0.005; 图三，B和C)。再者，在放射处理后24小时与两周之后，分别有相较于控制组多8倍与5倍的循环中肿瘤细胞量（表一）。在实验组与控制组间，原发肿瘤的生长率并无不同（资料未呈现）。

将培养中的PyVmT细胞暴露在1.25 - 7.50 Gy下，会增加其产生TGF-β的量（图四A）。在以上所述之研究过程中，有既成之肿瘤的老鼠才会施加放射线处理；循环中TGF-β浓度的增加，有可能是因为放射线在癌症细胞上的作用，因此我们想排除掉这个可能。我们对未交配的FVB母鼠施加了10 Gy的胸腔放射。在放射处理后一个小时，我们从尾部静脉注入了表现PyVmT 且受 luciferase 稳定转染(stably transfected)的肿瘤细胞。肺脏中的肿瘤细胞负荷量(tumor cell burden)，是在肿瘤细胞的注入之后，使用活体内(in vivo)与活体外(ex vivo)的生物发光来监测的。经放射线处理的老鼠肺脏，表现了较控制组为高的生物发光讯号（图四B），此讯号与人工计数之表面肺癌转移数量是相关连的，亦与肺脏重量相关（图四，C与D）。

TGF-β中和抗体阻断了受放射线诱导增加之肺部癌症转移。我们使用了2G7中和泛TGF-β IgG2抗体 (2G7 neutralizing pan-TGF-β IgG2)来验证，放射线所诱导增加的循环中TGF-β浓度，是否在肺癌转移中扮演一个成因的角色。这个单株抗体阻断了所有三种哺乳类所具有的TGF-β异构物，并且在活体中有活性。八周大的MMTV/PyVmT基因转殖鼠，在胸腔放射处理的2小时之前，以15mg/kg 之2G7或PBS注射至腹腔中。这些处理持续每周两次，到第十三周为止，此时将老鼠牺牲并测量是否肺部有癌症转移。然而有趣的是，施打2G7到未经放射线处理的老鼠中，少许增加了肺癌转移，但在统计上并不显著（图五A和B）。在两种实验组别之间，并未存在原发肿瘤细胞负荷量的差异（资料未呈现）。

我们收集了血液并体外培养其细胞悬浮液，以估计在循环中的肿瘤细胞量。从未经放射处理与经过放射处理的老鼠身上，血液中取得而培养的细胞群落数，均因施加2G7而显著地减少（图五C）。最后，我们检验了在体外添加2G7以抑制TGF-β，是否会阻止老鼠血液中取得之肿瘤细胞群落生长。将带有肿瘤、经过放射处理的老鼠所取得之血液，接种于含有2G7与不含有2G7的环境下，而在十天之后评估其集落生长情形。将细胞培养在存有2G7的环境下，发现会降低70%的细胞群落数（图五D），这表示自泌性的(autocrine) TGF-β对于表现PyVmT的循环中癌症细胞，是一种存活因子。

放射线诱导增加肺部癌症转移，需要肿瘤细胞内的TGF-β受器。以上描述的结果显示，因放射线诱导之循环中TGF-β浓度提升，是对于循环中肿瘤细胞的存活信号，让细胞可以移居至肺脏、在肺脏里生长。因此我们推论，藉由移除细胞对循环中TGF-β的反应，以使得TβRII 不存在于MMTV/PyVmT肿瘤中，就可以抵销放射处理在癌症转移上的效应。为检验此推论之可能，我们使用了表现PyVmT的肿瘤细胞，并且用Cre-Lox技术将TβRII有条件地于细胞中移除。含有或未含TGFBR2的PyVmT表现型肿瘤细胞株（在此之后将称为PyVmT/TGFBR2^flox/flox or PyVmT/TGFBR2^KO）是分别从PyVmT/TGFBR2^flox/flox 及 PyVmT/TGFBR2^KO老鼠身上的乳腺癌所产生。PyVmT/TGFBR2^flox/flox 及PyVmT/TGFBR2^KO细胞株均以luciferase之载体稳定转染，且经由尾部静脉注射入八周大、未交配的FVB母鼠，这些母鼠有些没有经过放射线处理，有些则是在注射肿瘤细胞之前1小时，施加了10 Gy的胸腔放射。两周后估计肺部癌症转移情形。在被注射PyVmT/TGFBR2^flox/flox 细胞的老鼠里，经放射处理之老鼠相较于控制组老鼠，发现生物发光讯号有所增加、肺部癌症转移增加6倍；但如果老鼠之前是被注射不含有TβRII的细胞，在施加与未施加放射处理的两组中，便没有差别（图六，A-C）。PyVmT/TGFBR2^KO 的肿瘤结节比 PyVmT/TGFBR2^flox/flox 的肿瘤结节还大，此结果与之前的一项报告是相符合的，也就是说，PyVmT表现型乳癌细胞之TβRII丧失，会增进肺部癌症转移的生长。经PCR扩增肿瘤组织中取得之DNA证实了在 PyVmT/TGFBR2^KO细胞中，是存在基因重组的（图六D）。

  讨 论  

我们在基因转殖老鼠的乳癌转移模型中，研究了癌症治疗所诱发的TGF-β是否会加速肿瘤的发生。在MMTV/PyVmT基因转殖鼠中，在肺部施加游离辐射或是以doxorubicin处理，都增加了循环中的TGF-β1量、循环中肿瘤细胞数以及肺部癌症转移。循环中TGF-β1浓度增加、之后的癌症转移增加，并不需要老鼠在施加处理时就拥有肿瘤，就如同我们也在放射处理后才施打肿瘤细胞的老鼠中所观察到的。TGF-β1会增加，并不仅限于受到胸腔放射处理的诱导，因为我们在骨盆的放射处理、以及全面性施加doxorubicin下，也都观察到了TGF-β1的受诱导增加。在放射处理后，循环中肿瘤细胞的增加以及肿瘤转移的增加，都因到2G7的施加而抵销。重要的是，循环中PyVmT表现型肿瘤细胞无法在有2G7的环境下进行体外培养，这也就表示了自泌性(autocrine)TGF-β对这些细胞是一种存活的讯号。这些结果与之前两项研究是相吻合的；在这些研究中，以可溶性TβRII:Fc融合蛋白、或用反义TGF-β1(antisense TGF-β1)稳定性转染加以阻断TGF-β，都抑制了肿瘤细胞的能动性、存活率、渗入(intravasation)以及肺部癌症转移。

老鼠身上的肿瘤不含TβRII，放射线便无法在这些老鼠身上加强肺部癌症转移。为了展示此点，我们从PyVmT/TGFBR2^flox/flox 与 PyVmT/TGFBR2^KO之老鼠身上既成之乳腺肿瘤，取得细胞株来使用。Forrester等人曾经提出报告，以MMTV/Cre表现有条件地使TGFBR2缺失时，这些knockout PyVmT表现型的肿瘤发生潜伏期就变短了许多，并且表现出明显增加的肺部癌症转移，这是相较于PyVmT/TGFBR2^flox/flox型的肿瘤。因为我们使用了静脉注射法，并且，我们所注入细胞株是从既成之含有TβRII与未含TβRII的肿瘤而来，所以我们的结果无法解释Forrester等人所报导之癌症潜伏与转移的表现。尽管我们在经放射处理的老鼠中无法排除TGF-β之增加，是否会影响宿主的微环境(microenvironment)与/或免疫系统，并进而帮助了肿瘤转移之进行，我们不含有TβRII之肿瘤的结果却强烈地显示，癌症转移之增加至少在部分上，是肇因于TGF-β在癌症细胞的直接作用。

在肿瘤细胞中，这些潜在受循环中TGF-β浓度调控的讯号反应，目前仍属未明。然而，TGF-β的助癌转移效应并不仅限于此基因转殖模型。举例说明，在MMTV/LTR启动子控制下表现有活性的TGF-β1与Neu的双基因型(bigenic)的老鼠，也表现出比MMTV/Neu更多的循环中肿瘤细胞与肺部癌症转移。会表现Neu和具活性的TGF-β1之乳腺肿瘤细胞，能侵入Matrigel并且能在transwells上移动，但却受可溶性的TβRII:Fc给阻断，表示单单Neu不足以诱导出一种侵略性的表现型。再者，在会表现具活性Neu的基因转殖肿瘤里，若共同表现具活性的突变种Alk5和TβRI，会增加肺部血管外的癌症移转(extravascular lung metastasis)，这与TGF-β之效应相符：也就是肿瘤周围蛋白酶、癌症细胞的附着和侵略。PyVmT是一个强而有力的癌症基因，我们也已经知道它会活化ErK和PI3K；但2G7竟然能对如此的肿瘤细胞具备有效的抗肿瘤移转效果，有点不符合直觉。但是，这表示TGF-β可以放大癌症基因的讯号，而只要这讯号大于某一阈值，可以完全地使肿瘤移转被观察到；并且，相反地，在肿瘤基因已恶性转化的细胞(oncogene-transformed cells)内阻断TGF-β讯号时，会把这些讯号降低至比阈值更低的程度，使其无法到达癌症基因诱导癌症进行。确实如此，在鳞状细胞癌(squamous cancers)中被逼着表现的显性-具活性Smad2，已经被证实会和有活性的Ras共同作用，使不具侵略性的肿瘤转变成会转移的肿瘤；但Smad突变型不与TβRI结合，并会抑制乳癌细胞的转移。最后，在Ras经恶性转化的细胞中，显性-不具活性且被截短的TβRI表现之后，则是会抑制肿瘤的产生能力(tumorigenicity)以及癌症移转。

癌症治疗后的肿瘤再增殖(repopulation)与发展，是一众所皆知的现象。它已被证实会在放射治疗、化学治疗以及手术摘除后发生。（在参考文献37中有回顾）。TGF-β的浓度会对放射线有所反应而增加，也被发现与放射治疗后之肺脏受伤有关，这是由胶原蛋白沉积、肺泡壁的增厚以及内皮细胞受伤所致。放射线引起的肺脏组织伤害，会因为施以抗TGF-β抗体而显著地减少。在手术方面，已经有人提出，因为组织操作以及伤口复原而产生的生长激素过量释放，包括TGF-β的过量释放，会紧接着手术之后促进癌症移转。确实如此，手术之后，循环中随即发现了肿瘤细胞的存在，也发现肿瘤细胞数量的增加；而且在治疗性切除直肠癌两周之后，若循环中的TGF-β浓度居高不下，就表示癌症会很快地转移至肝脏。相反地，在手术刚切除直肠肿瘤后，血清中的TGF-β浓度却是显著地降低的。最后，以化学-放射治疗处理后期的头颈部癌症，以及以化学治疗处理非小型细胞肺癌(non-small-cell lung cancers)的情形下，循环中的TGF-β浓度已被证实和对治疗的反应相关。

在本研究中，我们展示了放射治疗与化学治疗会提升循环中的TGF-β浓度、循环中的癌症细胞数、以及癌症的移转。这些效应会因为系统性地施加2G7而被阻断，因此支持TGF-β为癌症转移进展之肇因的说法。这些数据有数个临床上的含意。第一，因癌症治疗而增加的循环中TGF-β浓度，应该要预前地探讨与监控，因为它可能是一种标记，代表肿瘤注定要在治疗之后快速地增长。第二，在循环中TGF-β浓度已被观察到增加的病人，其身上带有的肿瘤，可能会因我们施加TGF-β抑制剂而加强基本疗程的效果，也可能可以抵销与疗程相关的毒性效应，例如放射线引起的组织伤害以及纤维化。我们预期，以我们现存的方法以及尚在临床研发中的治疗用TGF-β抑制剂，这些假说在不久的将来可以被证实

TGF-β1的生物检测。貂肺脏内皮报告细胞(mink lung epithelial reporter cell)在PAI-1启动子控制下，稳定地表现萤火虫luciferase。这些细胞接种于12-well 培养皿上 (2x10⁵/well)并且留置过夜供其贴附。已知浓度的可溶性TGF-β1或肺脏组织的细胞裂解液(250μg/well)加入了三次，而这些细胞被留在5%二氧化碳、37°C的环境下培养了另外24小时。在清洗之后，这些细胞被收取至200μg/well的裂解缓冲液中(Dual Luciferase Kit; Promega)，luciferase的活性则是在依据厂商提供的实验步骤下进行了测量。

DNA萃取与聚合酶连锁反应(PCR)。以石蜡固定的肿瘤切片被取出和重新添加水分。趁着还潮湿的时候，肿瘤部分以经消毒之刀片刮取至经消毒的eppendorf管中。DNA萃取是使用Instagene (Bio-Rad)并依厂商提供的实验步骤所完成。DNA样本储存在-20°C，除非要另外使用。Cre诱导的PyVmT/TGFBR2^KO肿瘤重组，是用PCR引子以及前述之反应条件下所验证的。

眼窝后(retroorbital)血液收集以及TGF-β1之定量。老鼠以1%-2% isofluorane麻醉。血液(约250μl/老鼠)采集于眼睛里的结膜静脉，作法是使用肝素化之Natelson tube (Fisher Scientific)然后再移转到肝素化的(heparinized)玻璃管中。血浆的制备是使用Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences)并依照厂商之使用说明进行，且增加了一个步骤，即在4°C下以10000g离心十分钟以除去血小板。为测量PyVmT表现型细胞之培养基中的TGF-β1，1 x 10⁶ 的细胞被涂布在含在完全培养基的10 mm盘上，并且供其贴附。该培养基在隔天被更换成无血清之培养基。隔夜培养后，细胞被施以1.25-7.5 Gy。过72小时后，培养基经收集并以快速真空法浓缩(3 ml to 500μl)。老鼠的血浆和受细胞条件培养基（cell-conditioned medium），均在下一步的TGF-β1的Quantikine Elisa kit (R&D Systems)中接受测试，依照的是厂商提供的实验步骤。标准曲线以31.5–2,000 pg/ml的人类重组TGF-β1绘出后，被用来计算TGF-β在老鼠血浆与细胞培养基中的等量。每项标本都在另外的重制实验中重复检验了三次。

TGF-β2之定量。依照厂商提供之实验步骤，在酸活化之后，血浆标本以TGF-β2 Quantikine Elisa kit (R&D Systems)测试。标准曲线以31.5–2,000 pg/ml的人类重组TGF-β2绘出后，被用来计算TGF-β2在老鼠血浆的等量。每项标本都在另外的重制实验中重复检验了三次。

老鼠的放射处理。MMTV/PyVmT基因转殖老鼠或正常的FVB母老鼠(Harlan)，在麻醉后把背部固定在镜台上。我们使用了单一的胸前辐射场，并使用了铅块掩护老鼠身体的其他部分。在某些实验中则是使用了一个单一腹部辐射场。老鼠被施加300 kVp 的X光，其剂量为 2.05 Gy/min。所有的老鼠都依照此法规Institutional Animal Care and Use Committee of Vanderbilt University Medical Center，被留在一个专门的无病原空间中。在动物暴露在放射线或其他处理后，喂食正常食物，并且详细观察是否有任何情绪不稳的迹象。

小红莓(doxorubicin)的处理。53天大的MMTV/PyVmT老鼠，经腹腔注射三次溶解于食盐水液中的doxorubicin (Adriamycin; 5 mg/kg; Sigma-Aldrich），每次间隔21天，直到第95天止。经无效空白试剂或小红莓处理之老鼠，其血液样本和肺脏组织，都于第107天解剖取得。为了要检查小红莓处理之后的循环中肿瘤细胞，经无效空白试剂或小红莓处理之老鼠，其血液在取得24小时后，又加入了单一剂量(5 mg/kg)。

侦测循环中肿瘤细胞。循环中肿瘤细胞之培养方法如前述，仅有少部分之修改。扼要地说，血液取得于心脏穿刺。细胞悬浮液（包括buffy coat以及红血球）从血浆中分离出后，接种在6-well盘上，这些盘上布有了生长激素减量之Matrigel (BD Biosciences)，并添加有DMEM、10%FBS，之后便于37°C、5%二氧化碳之温箱中培养。隔天，在每个well使用了红血球移除缓冲液(4.15 g NH4Cl, 0.5 g NaHCO3, 0.0186 g disodium EDTA in 200 ml water)以及PBS，数次缓和的冲洗。DMEM与10%FBS(3ml/well)添加后，新鲜的培养基每三天将会补充一次。过了10-12天后，以人工计数大小为50μm以上之细胞集落。PyVmT表现是用免疫细胞化学方法来侦测的。扼要地说，吸出培养基、以PBS清洗wells，然后细胞集落以10%中性缓冲的福尔马林(formalin)，在室温下固定30分钟，再用PBS清洗2次，再于室温下与PBS中之3%BSA共存1小时。培养盘接着培养隔夜，于4°C置放于含有生物素标记的抗PyVmT的老鼠单株抗体(diluted 1:500, BIOT-115L; Covance)。然后，加入与streptavidin结合之荧光二级抗体(Oregon Green 488; Invitrogen) 室温下1小时，之后使用Hoechst 细胞核染色法(1 μg/ml 十使用分钟)。免疫荧光是以Leica DM IRB 倒置显微镜所观察的。

生产反转录病毒载体以及细胞转导。MMTV/PyVmT细胞，是以luciferase之载体稳定转染的。一个luciferase cassette从pGL3-Basic (Promega)裁切下来，并嵌入pMSCV-puro (Clontech)之多重复制位上。amphotropic packaging Phoenix cells 转染后，产生感染性病毒颗粒，如前述。培养生长中(subconfluent)之癌症基因表现细胞，在4 μg/ml Polybrene (Sigma-Aldrich)中，以病毒上清液转导6小时，而含有病毒颗粒的培养基在6小时之后更换；在48小时后，再添加含有10%已经加热变性之FCS的DMEM，并于7-10天后将抗药的细胞集落合并。

肿瘤产生能力以及肿瘤转移之研究。在1%–2% isofluorane 之麻醉下，MMTV/PyVmT/Luc 细胞(2 × 10⁶ cells in 200 μl PBS) 被注射于FVB母鼠的左侧四号乳腺脂肪垫。扼要地说，在注入肿瘤细胞之前，脂肪垫便已经以手术使其暴露在外，而伤口以干净夹子密合，并于10天之后取走。每周以生物发光法检查肿瘤两次，并系列地以测径器测量之。这些肿瘤的以立方公厘(mm³)计算之体积，是以此数学式计算：v = (w2 × l)/2，v代表体积，w代表宽度，l代表长度。当肿瘤达到了200 mm³或更大的体积（约两周时间），老鼠就被施以放射线处理，或是不作任何处理。老鼠继续每周两次接受生物发光法的监控观察，直到实验终结。两周之后，将老鼠牺牲并取得基本的肿瘤与肺脏。以解剖显微镜计算肺脏表面之癌症转移数，之后这些肺脏以10%中性缓冲之福尔马林(formalin)固定之。固定好的肿瘤切片，以H&E染色之，并以显微镜检查是否有肺癌之转移。血液是由心脏穿刺取得以如前述，测量TGF-β之浓度以及循环中之肿瘤细胞数。

在其他的情形里，我们使用了MMTV/PyVmT、PyVmT/TGFBR2^flox/flox或PyVmT/TGFBR2^KO细胞来表现luciferase。2.5 × 10⁶ 之单一细胞悬浮液制备后，重新溶于无菌之PBS液中。0.5 × 10⁶ (in 200 μl)的细胞被注射入FVB母鼠之侧面尾部静脉中。静脉注射24小时后，肿瘤细胞于老鼠肺部之位置，以生物发光法确定之，并且自此之后每周追踪两次。为了要在活体内阻断TGF-β，在把10 Gy注入老鼠胸腔的前24小时，将15 mg/kg的2G7注入老鼠腹腔内，每周两次，持续进行，直到老鼠死亡。

生物发光法显影技术。要将生物发光之讯号与肿瘤负载量建立定量的对应关系，先以溶解于去离子水的 luciferin substrate (d-luciferin potassium salt; Promega)进行腹腔注射(0.15 mg/g body weight)，在注射之后12分钟内取得影像。根据我们之前的时间记录之实验，在此时间记录讯号高峰处之强度（资料未呈现）。在取得影像时，将老鼠以isofluorane麻醉。生物发光显影是以Vanderbilt University Small Animal Imaging Center的 IVIS-200 显影系统 (Xenogen)完成的。我们采用了3-5分钟的整合计算时间，并使用on-chip binning of 8，以增加讯号-噪声比。生物发光显影之定量分析是以Living Image software (Xenogen)完成，我们在此定义了感兴趣区域（regions of interest，ROI）并测量了integrated photon counts。

放射线与化学治疗增加循环中TGF-β1浓度。 (A) 10 Gy 的放射线被施加于FVB老鼠之胸腔(thorax) (左)或骨盆腔(pelvis )(右)。24小时之后取得血液，血浆中之TGF-β1浓度以在「方法」中所述测量。(B) 八周大、带有肿瘤之MMTV/PyVmT 老鼠，或非基因转殖之FVB 老鼠，在四号乳腺脂肪垫带有200mm³以上大小之肿瘤，不作任何处理或施加10 Gy 于胸腔。血浆中TGF-β1浓度，24小时后测量之。(C) 在第八周起，每隔21天，以空白试剂或腹腔注射小红莓 (5 mg/kg i.p.)，处理基因转殖老鼠三次。血浆中TGF-β1浓度在第十五周测量之。A–C 之数据代表三个不同的独立实验，每组使用三个实验对象。(D) FVB老鼠胸腔被施加10 Gy。五周后，取得经放射线处理、控制组老鼠之肺脏，及其细胞裂解液(250 μg/ml)，加到含有貂肺上皮细胞的triplicate wells，这些细胞会稳定地表现plasminogen activator inhibitor–1/luciferase reporter (PAI-1/luciferase reporter)。二十四小时后，测量luciferase之表现，方法如「方法」部分中所述。图示：*表示P P P 

放射线与化学治疗增加循环中肿瘤细胞量以及肺部之肿瘤转移。(A) MMTV/PyVmT母鼠在八周大时，接受胸腔放射线处理。在第十三周时，当实验终结，以心脏穿刺取得血液，并量取其细胞悬浮液在体外产生细胞集落之能力，如「方法」中所述。CTCs代表循环中肿瘤细胞（circulating tumor cells）。在下面为一些具有代表性的影像，是由血液中取得、循环中单一个肿瘤细胞形成的细胞集落。基因转殖成功的细胞集落，用PyVmT抗体和荧光之次级抗体处理，并以荧光显微镜观察并估计之。(B) 与A 同样之老鼠，在第十三周大时计算肺部表面癌症之转移数目。A和B中之数据是代表三个独立的实验，每组中有四只老鼠。从控制组以及经放射线处理之基因转殖老鼠上，取得具代表性之 H&E 染色的肺部组织切片。这些切片是胸腔放射处理后五周所取得，如下方所示。黑色箭头所指为肺部癌症转移。(C) 八周大、带有肿瘤的 MMTV/PyVmT 基因转殖老鼠，每隔21天以空白试剂或腹腔注射小红莓(5 mg/kg i.p.)处理共三次。此实验于第十五周时终结，并计算肺部表面之癌症转移数量。具代表性之H&E染色肺部切片，其含有癌症转移部分的中心如右方图示。原始放大倍率为100倍。*表示P P 

放射线的先行处理，会使移转的肺癌细胞更能够拓展在原本无肿瘤的老鼠身上。(A) MMTV/PyVmT 细胞，在加有不含血清之培养基之100-mm 培养皿里，以1.25–7.5 Gy处理。受细胞所影响之培养基在72小时后进行收集，并以如「方法」中所述之ELISA得知TGF-β1之浓度。(B) 稳定表现luciferase之MMTV/PyVmT 细胞，由尾部静脉注入未交配之FVB母鼠。在接受细胞注射1小时之前，老鼠在图中所标部分之胸部，以10 Gy处理之。在注射之后2周，肺部之癌症细胞以老鼠的生物发光法进行视觉观察（顶图）。某些情形中，肺脏在添加d-luciferin之后被手术移除，并于体外进行显影（底图）。控制组如左图所示，受放射线处理之老鼠如右图所示。(C) 具代表性的整体肺部载片（顶图）以及控制组与放射线处理组之H&E肺部切片(底图；原放大倍率为100)。(D) 在控制组与放射线处理老鼠中，肺部表面癌症转移之定量（左图）与肺部重量（右图）。数据为两个独立实验中，每组的五只老鼠的平均值±标准差。图示：**表示P P 

TGF-β中和抗体2G7，阻断了放射线诱导增加的肺部癌症转移。(A和B) 八周大、 带有肿瘤的MMTV/PyVmT老鼠于胸腔接受10 Gy处理。在图中标出之部分，老鼠被每周两次施以15 mg/kg 的2G7，直到第十三周。此时进行肺部表面之癌症转移计数。(A) 数据为每组中五只老鼠的平均值 ± 标准差。(B) 代表性的H&E 染色肺部切片。此实验重复一次取得了类似的结果。(C)当实验终结，以心脏穿刺取得血液，并量取其细胞悬浮液在体外产生细胞集落之能力，如「方法」部分中所述。(D) 在第十三周，经过胸腔放射处理、带有肿瘤的基因转殖鼠，收集血液。细胞悬浮液如C图中情形，在20 μg/ml 2G7或PBS环境下，涂布于培养盘上。10-12天后，人工计数等于或大于50 μm的细胞集落。数据为每组五只老鼠的平均值±标准差。*表示P P 

肿瘤细胞中不存在TGFβRII，能抵销受放射线诱发的肺部癌症转移之增加。(A–C) 未交配的、八周大的FVB母鼠，从尾部静脉注入稳定表现 luciferase的PyVmT/TGFBR2^flox/flox 与PyVmT/TGFBR2^KO 细胞。这些老鼠在注射肿瘤细胞之前，一组接受、一组未接受胸腔的10 Gy处理。两周后，以生物发光(A)、组织染色(B)、以及人工计数肺部表面癌症转移(C)的方法，来测定肺部表面癌症转移，如「方法」中所述。资料为每组中四只老鼠的平均值± 标准差。 (D) 两组细胞株的基因体DNA之PCR结果，显示重组片段的仅存在于PyVmT/TGFBR2^KO细胞中。**表示P 

译者：Jeffrey Chu at Hsinchu, Taiwan. 2009/4/4

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